Опухолевая клеточная линия

Характеристика

первичных злокачественных опухолей печени после введение мышам C57Bl/6 генетических конструкций с временной экспрессией Cas9 и гидовых РНК против онкосупрессоров p53, PTEN, RB1, Axin1

• Гепатоцеллюлярный рак
• Формирование опухолей на 3 месяц после инъекции генетической конструкции
• Образование метастазов в лёгких в 10% случаев
• Высокое сходство с гепатоцеллюлярной карциномой человека по морфологии и клиническому течению

Стратегия индукции канцерогенеза у мышей de novo

Инактивация онкосупрессоров → в норме (без мутаций) эти гены защищают от роста опухолей

Онкосупрессоры:

• Trp53 - (мут.) в опухолях печени как и во многих других встречаются чаще, чем в каких-либо других генах, в 30% случаев
• PTEN - (мут.) входит в двадцатку наиболее часто мутирующих генов при гепатоцеллюлярной карциноме
• Rb1 - мутирован в 5,1 % всех случаев рака
• Axin1 - мутирован в 10% опухолей при гепатоцеллюлярной карциноме

Схема создания клеточных линий злокачественных опухолей мышей, индуцированных геномным редактированием онкогенов и онкосупрессоров in vivo

Наработка векторов

• Генетические вектора на основе плазмиды PX459 содержат U6 промотор, последовательность гидовой РНК, направленной на гены онкосупрессоры и последовательность белка-нукеазы Cas9, необходимой для внесения драйверных мутация для онкогенеза.
• На клеточной линии NIH/3T3, методом секвенирования по Сенгеру, проверена эффективность всех разработанных вариантов для инактивации онкосупрессоров – все четыре конструкции «выключают» целевые гены Trp53, PTEN, Rb1, Axin1.

Введение векторов для изменения генома

• Гидродинамическая инъекция в хвостовую вену — метод доставки растворов генетических конструкций взрослым мышам. Он заключается в быстром (за 4-8 секунд) введении большого объема жидкости, равного ~10% веса животного.
• Раствор, движущийся против кровотока, в основном попадает в печень. Это вызывает временную сердечную недостаточность и повышение давления, что приводит к повреждению гепатоцитов (набухание органелл, образование вакуолей). Образование вакуолей свидетельствует о активном поглощении клетками введенного материала.
• Несмотря на масштабное воздействие, метод малотоксичен: лишь около 5% гепатоцитов подвергаются некрозу или апоптозу.

Анализ образцов развившихся опухолей печени

• Фотофиксация печени мышей на момент некропсии.

• Патогистологический анализ: органы фиксируют в 10% буферном растворе формалина (рН 7,4), сохраняют в 70% спирте, далее обезвоживают 99,7% изопропанолом и заливают парафином; полученные на микротоме срезы в 3 мкм депарафинизируют, гидратируют и окрашивают гематоксилином и эозином.

• Генетический анализ: экстракция ДНК, гель-электрофорез, выделение продуктов ПЦР, секвенирование по Сенгеру.

Криоконсервация злокачественных опухолей печени

• Первичные образцы опухолей прививаются мышам с целью последующей криоконсервации образца.
• Для криоконсервации используется обработка образцов коллагеназой IV для дезагрегации опухоли и получения суспензии отдельных клеток; после инкубации с коллагеназой отделяются отдельные клетки, которые затем отмываются от коллагеназы и ресуспендируются в новой среде; для криоконсервации используется среда DMEM/F12; полученные криостоки хранятся в криохранилище, заполненном жидким азотом.